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Auflicht-Kontrastverfahren


Wozu dient ein Kontrastverfahren?

Mit einem Kontrastverfahren werden Details und optische Eigenschaften einer Probe für das menschliche Auge sichtbar gemacht (kontrastiert). Lichtwellen haben viele Eigenschaften, die vom menschlichen Auge nicht wahrgenommen werden können. Beispiele sind die Polarisation des Lichts oder eine Phasenverschiebung von Lichtwellen. Alle Kontrastverfahren werden mit dem Ziel eingesetzt, die für unsere Augen nicht sichtbaren Eigenschaften des Lichts sichtbar zu machen. Dies läuft immer auf eine Übersetzung der ursprünglichen Lichtinformation hinaus: Die von unseren Augen nicht wahrnehmbaren Eigenschaften des Lichts werden in die folgenden wahrnehmbaren Eigenschaften umgewandelt:

  • Helligkeit (auch Amplitude genannt)
  • Farben (verschiedene Wellenlängen des elektromagnetischen Spektrums von ca. 380 bis 780 Nanometern)

Der generelle Aufbau eines Auflichtmikroskops

Ein klassisches Auflichtmikroskop besteht immer aus den folgenden Komponenten:

  • Auflichtachse
  • Lichtquelle
  • Apertur- und Leuchtfeldblende
  • Reflektorrevolver
  • Strahlteilerspiegel
  • Auflichtobjektive

Auflichtmikroskope werden üblicherweise in der Analyse von Materialien und Oberflächen eingesetzt. Beispiele sind die Metallographie sowie die Analyse von medizinischen und elektronischen Produkten. Auch Halbleiter können durch Auflichtmikroskope begutachtet werden. Klassische Auflichtmikroskope sind übrigens nicht mit Stereomikroskopen zu verwechseln: Diese arbeiten zwar auch mit Auflicht, es handelt sich jedoch um einen grundlegend anders aufgebauten Mikroskoptyp.





Auflicht-Hellfeld

Beim Auflicht-Hellfeld handelt es sich um das Verfahren, das man zuerst vor Augen hat, wenn man an ein Auflichtmikroskop denkt: Das Licht der Lichtquelle wird durch das Objektiv direkt auf die Probe gelenkt. Das von der Probe reflektierte Licht wird dann wiederum von den Objektiven eingefangen und in den Okularen sichtbar gemacht. Bei dieser Form der Beleuchtung sind die Objektive also sowohl für die Beleuchtung selbst, aber auch für die Bildgewinnung zuständig. Man spricht daher von einer koaxialen Beleuchtung, da für die Beleuchtung und die Beobachtung die gleiche Lichtachse verwendet wird.

Die eigentliche Bildinformation entsteht auf der Probe: Hier wird das Licht je nach Beschaffenheit der Probe reflektiert sowie teilweise oder komplett absorbiert. Dadurch entstehen beispielsweise die charakteristischen Korngrenzen in der Metallographie.

Damit ein Auflichtmikroskop funktioniert, wird ein Strahlteiler in Form eines halbdurchlässigen Spiegels benötigt. Dieser Spiegel leitet zum einen das Licht der Auflichtachse in Richtung Objektiv, lässt jedoch zum anderen das von der Probe reflektiere Licht durch, sodass das Bild in den Okularen sichtbar wird. Die Ausleuchtung der Probe kann wie bei einem Durchlichtmikroskop mithilfe der Aperturblende und der Leuchtfeldblende angepasst werden. Klassische Anwendungen der Hellfeldbeleuchtung sind wie folgt:

  • Schliffbilder in der Metallograhpie
  • Analyse von Elektronik-Platinen in der Aufsicht und im Querschnitt
  • Begutachtung von Schweißverbindungen (z.B. Bestimmung des a-Maßes)

Auflicht-Dunkelfeld

Wenn es um die Detektion feinster Oberflächendefekte wie Kratzer und Risse geht, kommt das Auflicht-Dunkelfeld sehr häufig zum Einsatz. Bei diesem indirekten Beleuchtungsverfahren wird das Licht nicht durch die Optik des Objektivs auf die Probe gebracht, sondern durch einen konzentrisch angeordneten, spiegelnden Ringkanal im Objektiv. Durch diesen Ringkanal wird das Licht in einem sehr flachen Einfallswinkel auf die Probe gelenkt. Bei einer flachen und spiegelnden Probe wird das Licht im gleichen Winkel reflektiert (Einfallswinkel = Ausfallswinkel). Der durch diese Technik entstehende hohle Lichtkegel erzeugt den dunklen Hintergrund im Bild – daher kommt auch der Name „Dunkelfeld“.

Um ein Auflichtmikroskop im Dunkelfeld zu betreiben, werden die folgenden Komponenten benötigt:

  • spezielle Auflicht-Dunkelfeldobjektive, die einen spiegelnden Ringkanal zur Beleuchtung haben
  • Dunkelfeldreflektor: Dabei handelt es sich um einen Spiegel, der das Licht in den Ringkanal des Objektivs lenkt
  • Objektivrevolver, der sowohl die Montage als auch die Beleuchtung der Dunkelfeldobjektive ermöglicht


Das Dunkelfeld wird unter anderem in den folgenden Bereichen eingesetzt:

  • Beurteilung feinster Kratzer und Risse
  • Analyse stark reflektierender Materialien, die im Hellfeld nicht gut dargestellt werden
  • Erkennung von Korngrenzen in der Metallographie
  • Detektion von Verunreinigungen

Fluoreszenz

Unter Fluoreszenz versteht man die Emission von Licht, nachdem ein Stoff mit Licht angeregt wurde. Dabei ist das emittierte (ausgesendete) Licht praktisch immer energieärmer als das Licht, mit dem der Stoff angeregt wurde. Dies zeigt sich in einer im Vergleich zum Anregungslicht längeren Wellenlänge des emittierten Lichts. Die zur Fluoreszenz fähigen Stoffe nennt man Fluorophore oder Fluorochrome.

Praktisch gesprochen zeigt sich z.B. nach der Anregung eines Fluorochroms mit energiereichem und kurzwelligem UV-Licht eine blaue, energieärmere Emission mit einer längeren Wellenlänge. Das Phänomen der Fluoreszenz ist keinesfalls auf die Mikroskopie begrenzt: Chlorophyll in Pflanzen zeigt beispielsweise bei der Beleuchtung mit UV-Licht eine kräftige, rote Emission. Auch in den Meeren gibt es viele Lebewesen, die zur Fluoreszenz fähig sind (z.B. Korallen).

Die Funktionsweise eines Fluoreszenzmikroskops basiert auf dem Prinzip eines Auflichtmikroskops. Die Auswahl der passenden Komponenten für die Fluoreszenz hängt im Wesentlichen vom verwendeten Fluorochrom ab. Im Unterschied zum Hellfeld oder Dunkelfeld wird eine spezielle Lichtquelle benötigt, die im Bereich der maximalen Absorption des Fluorochroms eine hohe Lichtintensität erzeugt.

Als Lichtquellen wurden in der Vergangenheit praktisch immer Quecksilberdampflampen (HBO) und Metallhalidlichtquellen (HXP) eingesetzt. Diese zeichnen sich durch eine hohe Lichtintensität sowie ein relativ kontinuierliches Spektrum aus. Als Nachteile sind bei diesen Lichtquellen eine mit 100-2.000 Stunden relativ kurze Lebensdauer zu nennen. Zudem ist bei HBO-Lichtquellen eine Justierung nach dem Lampenwechsel notwendig. Beide Lichtquellen haben die Eigenschaft, dass die volle Lichtleistung erst nach einer längeren Aufwärmphase zur Verfügung steht.

Die genannten Nachteile der konventionellen Lichtquellen treten bei modernen LEDs nicht auf: Die volle Lichtleistung steht direkt nach dem Einschalten zur Verfügung und ein Lampenwechsel ist aufgrund der Lebensdauer von ca. 25.000 Leuchtstunden nicht notwendig. Zudem ist der Einbau sehr einfach und eine Justierung durch den Anwender ist nicht notwendig. Durch die genannten Eigenschaften ergibt sich ein sehr hoher Bedienkomfort. Auch aus wirtschaftlicher Sicht sind die LEDs von Vorteil, da der Betrieb durch die lange Lebensdauer und den deutlich niedrigeren Stromverbrauch sehr kostengünstig ist.

Neben der Lichtquelle muss auch der Fluoreszenz-Filtersatz genau zum verwendeten Fluorochrom passen. Ein Filtersatz für die Fluoreszenz besteht aus insgesamt drei Teilen:

  • Anregungsfilter, auch Exzitationsfilter genannt: Dieser Filter ist für eine oder mehrere definierte Wellenlängen durchlässig, die beim Fluorochrom für eine Anregung sorgen.
  • Strahlteilerspiegel, auch dichroitischer oder dichromatischer Spiegel genannt: Dieser spezielle Spiegel sorgt dafür, dass die Wellenlängen des Anregungsfilters reflektiert und entsprechend auf die Probe gelenkt werden. Für die Wellenlängen des von der Probe emittierten Lichts ist der Strahlteilerspiegel hingegen durchlässig.
  • Emissionsfilter, auch Detektionsfilter genannt: In diesem Filter werden vom emittierten Licht nur die Wellenlängen durchgelassen, die für die Betrachtung der Probe gewünscht sind. Wenn eine Probe beispielsweise grünes und gelbes Licht emittiert, jedoch nur das grüne Signal von Interesse ist, werden die gelben Anteile im Emissionsfilter herausgefiltert.



In der Fluoreszenz kommen hauptsächlich drei Filtertypen zum Einsatz. Es wird zwischen Bandpassfiltern, Langpassfiltern und Multibandfiltern unterschieden. Ein Bandpassfilter lässt nur die Wellenlängen passieren, die innerhalb eines definierten Wellenlängenbandes liegen (z.B. grünes Licht zwischen 520 und 550 nm). Langpassfilter hingegen sind für Licht ab einer festgelegten Wellenlänge durchlässig (z.B. ab 470 nm aufwärts). Multibandfilter verhalten sich wie eine Kombination mehrerer Bandpassfilter: Hier kann nur Licht passieren, das innerhalb verschiedener definierter Wellenlängen liegt (z.B. zwischen 500 - 530 nm und 570-595 nm). Multibandfilter werden vor allem bei LED-Fluoreszenzlichtquellen eingesetzt.

Die Auswahl des passenden Filters ist eine der größten Herausforderungen bei der Konfiguration von Fluoreszenzmikroskopen. Da es viele tausend verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gibt, sind ähnlich viele Filtersätze erhältlich. Häufig ist es so, dass gleich mehrere Filtersätze für ein Fluorochrom passen. Hier muss dann im Einzelfall entschieden werden, welcher Filtersatz am besten zur Anwendung des Kunden passt.

Neben der Beleuchtung spielt in der Fluoreszenz auch die Auswahl der Objektive eine entscheidende Rolle. Es gibt verschiedene Objektivklassen mit unterschiedlichen Charakteristika. Neben den klassischen Merkmalen von Objektiven (Auflösung, Farbkorrektur und Bildfeldebnung) spielt die Lichtdurchlässigkeit der Objektive in der Fluoreszenz eine entscheidende Rolle. Diese Eigenschaft wird auch als Transmission bezeichnet. Günstige Glassorten haben eine relativ geringe Transmission, was bei einfachen Verfahren wie beispielsweise im Hellfeld keine große Rolle spielt: Bei einem zu dunklen Bild kann man einfach die Helligkeit an der Lichtquelle nachregulieren, was aufgrund der hohen Leistungsfähigkeit moderner Lichtquellen unproblematisch ist. Bei der Fluoreszenz hingegen handelt es sich um ein ohnehin lichtschwaches Verfahren, sodass die Transmission der Objektive hier sehr wichtig ist. Daher gibt es Objektive, die für die Fluoreszenz optimiert sind und eine entsprechend hohe Transmission haben. Es handelt sich dabei üblicherweise um semiapochromatische Objektive mit Linsen aus Fluorit oder ähnlichen Materialien, die auch im UV-Bereich eine hohe Lichtdurchlässigkeit haben.

Die Fluoreszenz wird im biologisch-medizinischen Bereich und auch im industriellen Umfeld eingesetzt:

  • Diagnostik von Pilzerkrankungen in der Dermatologie (z.B. Candida albicans): Hier hat die Fluoreszenz eine extrem hohe Sensitivität.
  • Krebsforschung und Tumordiagnostik: Nachweis spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen, z.B. mit der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
  • Bestimmung der Schichtdicke von Lacken und Beschichtungen in der Industrie
  • Erkennung von feinsten Rissen, beispielsweise in metallischen Oberflächen

Um ein Auflichtmikroskop mit Fluoreszenz betreiben zu können, sind mindestens die folgenden Komponenten notwendig:

  • Fluoreszenz-Lichtquelle (passend zur Anregungswellenlänge der eingesetzten Fluorochrome)
  • Fluoreszenzfiltersatz (passend zu den Anregungs- und Emissionswellenlängen der eingesetzten Fluorochrome)
  • zur Anwendung Passende Objektive
  • optionaler Shutter, um kurze Belichtungszeiten zu ermöglichen

Auflicht-Polarisation

Mit dem Begriff der Polarisation wird die Schwingungsrichtung von Lichtwellen beschrieben. Das menschliche Auge kann die Polarisation von Lichtwellen ohne technische Hilfe nicht kontrastreich erfassen. Ein solches technisches Hilfsmittel ist der Polarisationskontrast, der auf zwei im Strahlengang hintereinander geschalteten Polarisationsfiltern basiert. Durch solche Polarisationsfilter können nur solche Lichtwellen gelangen, die in einer definierten Schwingungsrichtung liegen. Alle anderen Lichtwellen werden herausgefiltert. Man spricht auch von einer linearen Polarisation des Lichts.

Lichtquellen haben in der Regel die Eigenschaft, dass das ausgesendete Licht unpolarisiert ist. Die Lichtwellen schwingen also in allen möglichen Ebenen entlang der Ausbreitungsrichtung. Der erste Polarisationsfilter, der im Strahlengang immer lichtquellenseitig eingesetzt wird, sorgt seinen Eigenschaften entsprechend für eine lineare Polarisation des unpolarisierten Lichts der Lichtquelle. Man nennt diesen Polarisationsfilter auch Polarisator.

Der zweite Polarisationsfilter wird im Strahlengang oberhalb des Objektivrevolvers eingesetzt. Bei einem Polarisationsmikroskop kann man die relative Ausrichtung der beiden Polarisationsfilter zueinander ändern. Mit einer um 90° gegeneinander gedrehten Anordnung kommt es zu einer vollständigen Auslöschung des Lichts, da die Durchlassrichtung der Polarisationsfilter genau entgegengesetzt ist. Man spricht in dieser Konstellation auch davon, dass Polarisator und Analysator „gekreuzt“ sind. Ein Drehen des oberen Polarisationsfilters lässt einen Rückschluss auf die Polarisationsrichtung der ankommenden Lichtwellen zu, weshalb dieser Filter auch Analysator genannt wird.

Die unter einem Mikroskop untersuchten Stoffe haben verschiedene optische Eigenschaften. Eine wichtige Eigenschaft ist die sogenannte optische Aktivität. Optisch aktive Stoffe sind in der Lage, die Polarisationsrichtung des Lichts sowohl im Auflicht als auch im Durchlicht zu ändern. Unter dem Polarisationsmikroskop mit gekreuztem Polarisator und Analysator zeigen sich optisch aktive Areale durch eine Aufhellung, wohingegen die optisch inaktiven Areale dunkel bleiben. Als Zubehör kann eine sogenannte Lambda-Platte in den Strahlengang eingefügt werden, welche den Polarisationskontrast deutlich verstärkt. Die Verwendung einer Lambdaplatte ist meistens an kräftigen und bunten Farben erkennbar, üblicherweise mit einem rot-violetten Grundton.

Wie im Durchlicht gibt es auch im Auflicht die sogenannte einfache Polarisation. Dabei werden Polarisator und Analysator in der Auflichtachse nachgerüstet, was bei den meisten Modellen problemlos möglich ist.


Da die optischen Komponenten jedoch nicht immer spannungsfrei eingefasst sind, zeigen normale Objektive häufig eine ungewollte Spannungsdoppelbrechung. Aufgrund dieses Phänomens leidet die Bildqualität bei einfachen Objektiven mehr oder weniger erheblich, weshalb spezielle Polarisationsausführungen bei kritischen Anwendungen notwendig sind. Mit den für die Polarisationsmikroskopie spannungsfrei eingefassten Komponenten hingegen lassen sich auch anspruchsvolle Polarisationsanwendungen, insbesondere in der Geologie, abdecken.

Reine Polarisationsmikroskope, die z.B. in der Geologie und in den Materialwissenschaften eingesetzt werden, haben eine andere Ausstattung als übliche Auflichtmikroskope. Neben dem Polarisator und einem Analysator findet man hier die folgenden Komponenten:

  • 360° Drehtisch, bei guten Mikroskopen mit 45° Raststellung
  • Spannungsfreie optische Komponenten ohne Spannungsdoppelbrechung
  • Depolarisator im Tubus zur Verhinderung von Pseudo-Pleochroismus
  • Verschiedenes Zubehör wie z.B. Kompensatoren

Klassische Anwendungen für die Auflichtpolarisation finden sich neben der Geologie in den Materialwissenschaften, z.B. in der Analyse von Metallen und anderen Werkstoffen. Durch die unterschiedlichen optischen Eigenschaften können mithilfe der Polarisation beispielsweise Partikel im Rahmen der Prüfung der technischen Sauberkeit zwischen metallisch und nichtmetallisch präklassifiziert werden. Häufig wird die Polarisation ergänzend zu anderen Kontrastverfahren wie z.B. dem Dunkelfeld eingesetzt.

Differentieller Interferenzkontrast im Auflicht

Der differentielle Interferenzkontrast – kurz DIC genannt – ist ein auf der Polarisation aufbauendes Kontrastverfahren. Die im DIC erzeugten Bilder zeichnen sich durch eine sehr hohe Auflösung sowie eine reliefartige Darstellung mit einem variabel einstellbaren Kontrast aus. Zur technischen Ausstattung gehört neben den Polarisationskomponenten (Polarisator und Analysator) ein sogenannter DIC-Schieber (auch DIC-Prisma genannt). Im Vergleich zum Durchlicht wird nur ein DIC-Prisma benötigt, da dieses sowohl den beleuchtenden als auch den abbildenden Strahlengang abdeckt.

Der differentielle Interferenzkontrast kommt aufgrund der vielseitigen Möglichkeiten sowohl bei Analysen im Materiallabor als auch in Forschungseinrichtungen zum Einsatz. Typische Anwendungsfelder sind die Oberflächenanalyse im Hinblick auf feinste Oberflächendefekte oder anderweitige Veränderungen. Weitere Anwendungen sind die Detektion von Fremdmaterialien oder die Analyse von Beschichtungen und Teilchen, die mit anderen Kontrastverfahren nicht eindeutig vom Grundmaterial zu unterscheiden sind. Ein Auflichtmikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast ist üblicherweise wie folgt ausgestattet:

  • Polarisator und Analysator (bei manchen Modellen gibt es diese Komponenten in einer speziellen DIC-Variante)
  • DIC-Prisma im Objektivrevolver
  • Objektivrevolver mit Aufnahme für DIC-Prisma
  • Spezielle DIC-Objektive, die auch mit anderen Kontrastverfahren genutzt werden können

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