Das menschliche Auge kann bei weitem nicht alle Eigenschaften von Lichtwellen wahrnehmen. Zu diesem Zweck wurden die Kontrastverfahren in der Mikroskopie erfunden: Man macht damit Dinge sichtbar, die uns sonst verborgen bleiben. Die Photorezeptoren unserer Augen - bestehend aus Stäbchen und Zapfen - können im Wesentlichen zwei Dinge wahrnehmen:
Helligkeit (auch Amplitude genannt)
Farben (verschiedene Wellenlängen des elektromagnetischen Spektrums von ca. 380 bis 780 Nanometern)
Mikroskopische Präparate verändern je nach Typ weit mehr Eigenschaften des Lichts als nur die Helligkeit und die Farbgebung. In diesem Zusammenhang sind hauptsächlich die Phasenverschiebung und die Änderung der Polarisationsrichtung von Lichtwellen zu nennen. Da weder die Phasenverschiebung von Lichtwellen noch deren Polarisationsrichtung von unseren Augen wahrgenommen werden können, benötigt man zur Sichtbarmachung verschiedene technische Hilfsmittel – eben die Kontrastverfahren. Das Grundprinzip ist dabei immer gleich: Die für das Auge unsichtbaren Eigenschaften des Lichts werden in für uns wahrnehmbare Eigenschaften übersetzt – also in Helligkeitsunterschiede und Farben.
Zur Veranschaulichung werden die folgenden Kontrastverfahren von Durchlichtmikroskopen anhand von Beispielen erläutert:
Hellfeld
Phasenkontrast
Dunkelfeld
Polarisation und differentieller Interferenzkontrast/DIC
Durchlicht-Hellfeld
Die einfachste und bekannteste Art der Beleuchtung von Durchlichtmikroskopen ist das sogenannte Hellfeld. Dabei durchläuft das Licht die Probe und wird dabei je nach Eigenschaften der Probe mehr oder weniger verändert. Gefärbte Proben haben die Eigenschaft, sowohl die Helligkeit als auch die Zusammensetzung der Farben des Lichts durch Absorption zu verändern. Man nennt solche Proben auch Amplitudenobjekte. Im Extremfall liegt die Absorption bei 100%: Die entsprechende Stelle im Präparat erscheint dann schwarz. An Stellen, an denen das Präparat kein Licht absorbiert, erscheint der Hintergrund in den Okularen hell – daher kommt auch der Name Hellfeld.
Beispiele für klassische Amplitudenpräparate in Medizin und Biologie sind wie folgt:
Histologische Schnitte in der Pathologie (Hämatoxylin-Eosin-Färbung, kurz HE-Färbung)
Zytologische Ausstrichpräparate (Färbung nach Papanicolaou, zur Früherkennung von Veränderungen in der Schleimhaut des Gebärmutterhalses)
Blut- und Knochenmarkausstriche in der Hämatologie (Färbung nach Giemsa zur Differenzierung verschiedener Zelltypen)
Mikroskopie von Pflanzenteilen in der Botanik (durch die Eigenfärbung des Chlorophylls ist keine Färbung notwendig)
Um ein Präparat im Durchlicht zu betrachten, benötigt man im Prinzip nur die Basisausstattung eines Durchlichtmikroskops: Objektive sowie eine Durchlichtachse inklusive Lichtquelle und Kondensor.
Phasenkontrast
Ungefärbte Präparate haben meistens die Eigenschaft, dass sie nur wenig Licht absorbieren. Dadurch können Helligkeitsunterschiede mit dem menschlichen Auge kaum wahrgenommen werden und das Bild erscheint sehr kontrastarm. Für die Betrachtung von ungefärbten Proben ist das „normale“ Durchlicht daher häufig nicht geeignet.
Neben der Absorption kommt es in Abhängigkeit des Präparats auch zu einer Phasenverschiebung der Lichtwellen: Je nach optischer Dichte der durchleuchteten Struktur breiten sich die Lichtwellen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aus. Dadurch kommen die Lichtwellen, die ein optisch dichteres Medium durchlaufen wie z.B. eine Epithelzelle, im Vergleich zu den Lichtwellen, die nur den Objektträger durchlaufen, verspätet am Objektiv an. Dies wird auch als Phasenverschiebung bezeichnet (s. Abbildung).
Das menschliche Auge ist nicht in der Lage, solche Phasenunterschiede wahrzunehmen. Hier kommt nun der Phasenkontrast ins Spiel: Mithilfe der passenden Ausstattung können Phasenunterschiede in Helligkeitsunterschiede umgewandelt werden, die wiederum für unser Auge gut wahrnehmbar sind. Die folgende Abbildung zeigt dieselbe Epithelzelle zum Vegleich im Hellfeld und im Phasenkontrast.
Für ein Phasenkontrastmikroskop werden im Wesentlichen zwei Komponenten benötigt
Phasenkontrast-Objektiv mit integriertem Phasenring: Hier wird die Phasendifferenz in einen Helligkeitsunterschied umgewandelt
Zum Objektiv passender Lichtring (üblicherweise in Form eines Phasenschiebers; alternativ in einem Kondensor mit Modulatorscheibe integriert, auch Revolverkondensor genannt)
Wichtig ist, dass ausschließlich die Originalteile des Mikroskopherstellers genutzt werden, da die Komponenten optimal aufeinander abgestimmt sein müssen. Objektive für den Phasenkontrast können übrigens bis zu einer Vergrößerung von 20-fach auch im Hellfeld genutzt werden. Bei höheren Vergrößerungen ist mit zunehmenden Einschränkungen in der Bildqualität zu rechnen, sodass hier je nach Anwendung reine Hellfeldobjektive zum Einsatz kommen.
Klassische Einsatzbereiche für Phasenkontrastmikroskope mit ungefärbten Präparaten sind wie folgt:
Abstrichpräparate in der Gynäkologie zur mikrobiologischen Untersuchung auf Bakterien und Pilze
Urinsedimente in der Urologie zur Untersuchung auf Bakterien, Erythrozyten und Leukozyten
Spermienanalyse (Spermiogramm) zur Beurteilung der Anzahl, Morphologie und Beweglichkeit von Spermien
Zellkulturen in der Zellforschung (die Färbung von Zellen wäre hier kontraproduktiv, da hierdurch die Zellen absterben würden)
Es zeigen sich die folgenden Vorteile bei der Arbeit mit dem Phasenkontrastmikroskop:
Zeitsparendes Arbeiten: Die Präparate sind sehr schnell erstellt und es ist kein Färben notwendig.
Durch die hohe Auflösung und den guten Kontrast ist eine verlässliche Diagnostik möglich.
Die Handhabung ist sehr einfach.
Für die bahnbrechende Erfindung des Phasenkontrasts wurde dem niederländischen Physiker Frits Zernike im Jahr 1953 der Nobelpreis verliehen.
Durchlicht-Dunkelfeld
Als Gegenpol zur Hellfeldbeleuchtung, bei der das Präparat vor einem hellen Hintergrund dargestellt wird, gibt es auch das sogenannte Dunkelfeld. Wie der Name schon vermuten lässt, wird die Probe hier vor einem dunklen Hintergrund dargestellt. Das Resultat sind kontrastreiche und faszinierende Bilder.
Der schwarze Hintergrund im Dunkelfeld kommt durch eine indirekte Beleuchtung zustande. Das Licht wird dabei im Gegensatz zum Hellfeld nicht in Richtung des Objektivs gelenkt, sondern in einem flachen Winkel durch das Präparat und am Objektiv vorbei. Beim Durchlaufen des Präparats entsteht dabei je Beschaffenheit mehr oder weniger Streulicht, das dann vom Objektiv eingefangen wird. Als Resultat erhält man ein fein aufgelöstes Bild vielen Details, die im Hellfeld sonst nicht sichtbar sind.
Je nach Anforderung lässt sich ein normales Durchlichtmikroskop mit nur wenig Aufwand durch eine Dunkelfeldeinrichtung erweitern. Bis zu einer Objektivapertur von 0,75 reicht im Regelfall die Nachrüstung eines Schiebers mit Dunkelfeldblende aus. Der Schieber wird in den Kondensor geschoben und erzeugt die indirekte Beleuchtung. Diese einfache Dunkelfeldausstattung funktioniert im Regelfall bis zu einer Objektivvergrößerung von 40-fach, also bis zu einer 400-fachen Vergrößerung im Mikroskop.
Wenn die Vergrößerung bis zu 1.000-fach betragen soll, ist ein höherer technischer Aufwand notwendig. Der technische Hintergrund stellt sich wie folgt dar: Je größer die Apertur (Öffnungsweite) des Objektivs ist, desto größer ist der Winkel, in dem das Licht vom Objektiv eingefangen wird. In der dargestelltem Abbildung sieht man links ein Objektiv mit einer niedrigeren Apertur und rechts ein hochaperturiges Objektiv. Es ist deutlich erkennbar, dass das Licht beim rechten Objektiv in einem größeren Winkel aufgenommen wird, als es beim Objektiv mit der kleineren Apertur links der Fall ist. Wenn die Apertur des Objektivs die innere Apertur der Dunkelfeldbeleuchtung überschreitet, wird wieder direktes Licht vom Objektiv aufgenommen. Dadurch würde sich teilweise wieder eine Hellfeldbeleuchtung mit einem hellen Bildhintergrund ergeben, was natürlich nicht erwünscht ist.
Um dieses Problem zu lösen, gibt es zwei technische Ansätze. Man kann zum einen die Beleuchtungsapertur des Dunkelfeldkondensors so weit erhöhen, sodass wieder kein direktes Licht ins das Objektiv einfällt. Dies wird durch sogenannte Immersions-Dunkelfeldkondensoren erreicht: Auf den Kondensor wird – wie bei Immersionsobjektiven – Öl aufgetragen, das einen hohen Brechungsindex hat. Dadurch lässt sich die innere Beleuchtungsapertur auf ca. 1,2 erhöhen. Zum Vergleich: Dunkelfeldkondensoren ohne Öl kommen auf eine maximale innere Apertur von ca. 0,8.
Die maximal erreichbare innere Apertur von 1.2 liegt jedoch immer noch über derjenigen von hochauflösenden Objektiven. Daher gibt es spezielle Dunkelfeldobjektive mit einer integrierten Irisblende, die über einen Ring am Objektiv eingestellt werden kann. Durch diese Blende kann die Apertur stufenlos reduziert werden, bis ein vollständiges Dunkelfeldbild erreicht wird.
Die Möglichkeiten einer Dunkelfeldausttattung lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Nachrüstung einer Dunkelfeldblende im Kondensor für Objektive mit einer Apertur von bis zu ca. 0,75 (ca. 400-fache optische Vergrößerung)
Ausstattung mit einem Immersionskondensor und einem hochaperturigen Objektiv mit integrierter Irisblende für bis zu 1.000-fache Vergrößerungen
Seit den Anfängen der Dunkelfeldmikroskopie wird dieses Kontrastverfahren in der Diagnostik von Spirochäten eingesetzt, die unterem anderem für Krankheiten wie Syphilis und Borreliose verantwortlich sind. Wenngleich es heute weitere Nachweismethoden für die Diagnostik von Spirochäten gibt, ist die Untersuchung mit dem Dunkelfeldmikroskop nach wie vor ein gutes Verfahren. Die Vorteile liegen in einer einfachen und guten Verfügbarkeit – auch in Regionen, in denen moderne Diagnoseverfahren wie z.B. Antikörpernachweise nicht verfügbar sind.
Parallel zur mikrobiologischen Diagnostik hat sich ein weiteres Anwendungsfeld der Dunkelfeldmikroskopie ergeben: Die Blutuntersuchung nach Professor Enderlein. Dabei wird ein Tropfen Blut auf einem Objektträger ausgestrichen und im Hinblick auf quantitative und qualitative Merkmale untersucht. Dieses Verfahren ist im Bereich der Alternativmedizin weit verbreitet und wird hauptsächlich von Heilpraktikern angewendet.
Polarisationskontrast im Durchlicht
Der Polarisationskontrast basiert auf der Eigenschaft von Lichtwellen, dass es verschiedene Schwingungsrichtungen bei der gleichen Ausbreitungsrichtung des Lichts geben kann. Die Schwingungsrichtung wird auch als Polarisation bezeichnet. Im Gegensatz zu vielen Insekten ist die Polarisation von Lichtwellen vom menschlichen Auge nicht bzw. nur mit einem sehr kleinen Kontrast wahrnehmbar. An dieser Stelle setzt der Polarisationskontrast an, indem er die Ausrichtung und die Änderung der Polarisation von Lichtwellen sichtbar macht.
Die Grundlage jedes Polarisationsmikroskops sind zwei hintereinander im Strahlengang positionierte Polarisationsfilter. Die Polarisationsfilter haben die Eigenschaft, die Lichtwellen in nur einer Schwingungsrichtung passieren zu lassen. Die übrigen Lichtwellen, die nicht in dieser Ebene schwingen, werden herausgefiltert.
Im ersten Polarisationsfilter, der lichtquellenseitig im Strahlengang positioniert ist, wird aus dem ursprünglich unpolarisierten Licht der Lichtquelle entsprechend ein linear polarisiertes Licht erzeugt. Daher nennt man diesen ersten Polarisationsfilter auch Polarisator.
Der zweite Polarisationsfilter befindet sich im Strahlengang hinter dem Objektiv. Auch hier wird wiederum nur linear polarisiertes Licht in einer Schwingungsrichtung durchgelassen. Da man mit diesem Polarisationsfilter die Schwingungsrichtung des ankommenden Lichts bestimmen kann, wird dieser Filter auch Analysator genannt.
Ordnet man Polarisator und Analysator um 90° gegeneinander gedreht an, kommt es zur vollständigen Auslöschung des Lichts. Man sagt dazu auch, dass Polarisator und Analysator gekreuzt sind. Je nach optischen Eigenschaften können viele Proben die Polarisationsrichtung des Lichts ändern. Man nennt solche Proben auch optisch aktiv. Legt man eine solche Probe unter ein Polarisationsmikroskop, erscheinen die optisch aktiven Bereiche in den Okularen hell und häufig farbig, wohingegen die optisch nicht aktiven Stellen der Probe dunkel bleiben. Man kann also optisch aktive von optisch nicht aktiven Strukturen unterscheiden, was in vielen Bereichen der medizinischen Diagnostik, aber auch in der Geologie von großem Vorteil ist. Je nach Bedarf kann der Kontrast des mikroskopischen Bildes durch eine sogenannte Lambda-Platte erhöht werden: Man erkennt solche Bilder an kräftigen und bunten Farben, meistens mit einem rot-violetten Grundton.
Bei der Ausstattung mit Polarisationskontrast wird zwischen zwei Möglichkeiten unterschieden. Bei der sogenannten einfachen Polarisation werden Polarisator und Analysator im Strahlengang nachgerüstet. Dies ist bei den meisten Compound-Mikroskopen als auch bei Stereomikroskopen möglich. Da die optischen Komponenten bei einfacheren Mikroskopen jedoch nicht spannungsfrei gefasst sind, kommt es zu einer sogenannten Spannungsdoppelbrechung. Dadurch verändern die nicht spannungsfreien optischen Komponenten die Polarisationsrichtung des Lichts, worunter die Abbildungsqualität leidet. Für einfache medizinische Anwendungen reicht das Bild jedoch aus.
Reine Polarisationsmikroskope, die z.B. in der Geologie und in den Materialwissenschaften eingesetzt werden, haben eine andere Ausstattung als biologische Durchlichtmikroskope. Neben Polarisator und Analysator findet man hier die folgenden Komponenten:
360° Drehtisch, bei guten Mikroskopen mit 45° Raststellung
Spannungsfreie optische Komponenten ohne Spannungsdoppelbrechung
Depolarisator im Tubus zur Verhinderung von Pseudo-Pleochroismus
Verschiedenes Zubehör wie z.B. Kompensatoren
In der Medizin wird der Polarisationskontrast unter anderem in den folgenden Bereichen eingesetzt:
Rheumatologie: Man findet bei an Gicht erkrankten Patienten Harnsäurekristalle in der Gelenkflüssigkeit.
Pathologie: Mithilfe der Kongorot-Färbung können abnorm veränderte Proteine bei einer Amyloidose nachgewiesen werden.
Differentieller Interferenzkontrast im Durchlicht
Ein weiteres Kontrastverfahren ist der differentielle Interferenzkontrast, auch DIC genannt. Mit dem DIC wird ein reliefartiges und sehr fein aufgelöstes Bild erzeugt. Grundsätzlich basiert der DIC auf dem Polarisationskontrast. Zusätzlich werden hier jedoch zwei doppelbrechende Prismen, auch DIC-Prismen genannt, in den Strahlengang gebracht: Das erste Prisma ist im Kondensor untergebracht und somit hinter dem Polarisator positioniert. Das zweite DIC-Prisma wird objektivseitig in den Strahlengang geschoben, üblicherweise in einen Schlitz im Objektivrevolver oder oberhalb davon.
Der DIC ist für Proben geeignet, die keine Eigendoppelbrechung haben. Dieses Kontrastverfahren wird im Durchlicht hauptsächlich bei ungefärbten Proben eingesetzt, bei denen eine Betrachtung mit einem hohen Kontrast und einer sehr hohen Auflösung notwendig ist. Dies ist hauptsächlich bei Forschungsanwendungen wie in der Zellforschung der Fall. Im Vergleich mit dem Phasenkontrast ist die Darstellung des Präparats deutlich detailreicher. Ein Mikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast ist wie folgt ausgestattet
Polarisator und Analysator (bei manchen Modellen gibt es diese Komponenten in einer speziellen DIC-Variante)
DIC-Prisma im Kondensor (es gibt auch DIC-Prismen mit integriertem Polarisator)
DIC-Prisma im Objektivrevolver
Objektivrevolver mit Aufnahme für DIC-Prisma
Spezielle DIC-Objektive, die auch mit anderen Kontrastverfahren genutzt werden können
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